SABER DE CIENCIAS

El laboratorio de Micología

El laboratorio de Bacteriología se adapta perfectamente al de Micología, pero es necesario contar con un incubador para 30ºC. Además cuando se trabaja con hongos muy patógenos es esencial

 tener una cabina de seguridad biológica en especial para Histoplasma capsulatum y Coccidioides inmitis que producen gran cantidad de esporas que pueden ser inhaladas por el laboratorista y cuasarle una infección pulmonar. Es peligrosa también la contaminación ambiental con estas esporas que pueden causar la infección a otras personas en el laboratorio.
Las muestras para Micología, con excepción de pelos, piel y raspados de uñas deben ser procesadas e inoculadas sobre los medios el mismo día en que se recolecta la muestra.
Los medios de cultivo recomendados para hongos son:
1- Agar Sabouraud glucosado: es excelente para el aislamiento de muchos hongos patógenos de sitios no contaminados.
2- Agar Sabouraud con antibióticos (cloramfenicol y cicloheximida): es ideal para inhibir el desarrollo de bacterias contaminantes pero pueden también ser inhibidas algunas especies de hongos, por ejemplo Candida spp.  Por esto se debe sembrar en ambos medios.
3- Agar infusión cerebro-corazón con 5% de sangre de conejo u oveja: es ideal para el aislamiento de Histoplasma capsulatum.

Los cultivos de hongos deben ser incubados durante cuatro semanas antes de ser descartados como negativos. En el caso de lesiones orales y muestras vaginales, deben ser descartados como negativos, luego de cinco días de incubación, sin desarrollo.

Diagnóstico micológico

Micosis superficiales

El diagnóstico de micosis superficiales, se realiza en base a la visualización en la muestra de hifas o esporos característicos en el examen microscópico directo y en el aislamiento del agente causal en los cultivos. Para ello se requiere una recolección de la muestra de la zona activa de la lesión y fundamentalmente indicar al paciente cómo debe prepararse. Esta es una importante etapa del estudio que tiene por objeto reducir en lo posible la contaminación con microorganismos presentes normalmente en la piel y evitar sustancias que dificulten la observación microscópica o que interfieran con el desarrollo del hongo.
La muestra a procesar puede ser raspados de piel, pelos y uñas.

Piel: cuando se trata de lesiones cutáneas se deberá pasar un algodón embebido en alcohol por el área de la piel donde se tomará la muestra para retirar contaminantes bacterianos superficiales. La muestra se toma del margen periférico y eritematoso de la lesión típica, raspando los bordes con un portaobjeto de vidrio o un bisturí. Las escamas así obtenidas se recogen en portaobjetos o cajas de Petri estériles

Uñas: en las onicomicosis distales, el material se obtiene raspando el lecho subungueal con un bisturí estéril. En las leuconoquias (manchas blancas de la tabla externa de la uña) se aconseja raspar esta zona y en las leuconiquias proximales profundas se debe prácticamente horadar la uña, para obtener material de todo el espesor de la tabla ungueal. Esta es probablemente la muestra de lesión de uña más difícil de obtener.

Pelos: deben recolectarse de áreas escamosas o alopécicas o arranca con pinza de depilar estéril el pelo parasitado, raspando la superficie cutánea para obtener escamas.

Las muestras así obtenidas  se someten a:

1- Examen microscópico directo: se debe proceder a clarar el material queratínico, utilizando KOH en concentraciones del 10 al 40%, o una mezcla de partes iguales de KOH al 40% y tinta Parker azul permanente. Cualquiera de estas preparaciones permite aclarar el material y visualizar los elementos fúngicos de las escamas. La observación al microscopio con óptica seca de las preparaciones de escamas de piel y uñas aclaradas permiten visualizar filamentos hialinos a veces ramificados y tabicados, como así también presencia de clamidoconidias. Cuando se trata de pelos se puede observar la presencia de hifas  dentro del tallo del pelo en un período de invasión inicial.
2- Observación de fluorescencia: de los pelos parasitados bajo la lámpara de Wood, se observa la presencia de los elementos micóticos fluorescentes. También se puede observar la fluorescencia verde amarillenta en microscopio de fluorescencia de los elementos micóticos.
3- Cultivo en Agar Sabouraud con cloramfenicol y cicloheximida: el cultivo nos permitirá observar los elementos de fructificación esenciales para la tipificación del agente etiológico así como las características macroscópicas de las colonias. Para cultivar se colocan las escamas de piel, raspados de uñas o pelos directamente sobre la superficie del medio. Unos pocos fragmentos se introducen en el medio con un ansa recta, para producir el máximo contacto con el medio. Incubar a temperatura ambiente y observar el crecimiento conservando el cultivo por un mínimo de 30 días, debido a que estos hongos son de lento desarrollo. 

Micosis subcutáneas y profundas

Dependiendo de la localización de la micosis, las muestras a examinar pueden ser: biopsia de lesiones, líquido cefalorraquídeo, sangre, orina, secreciones respiratorias como esputo o lavado bronquial, tejidos, médula ósea, raspados corneales, raspado de mucosa oral, etc.
Las muestras se someten a:
1- Examen microscópico directo: consiste en la observación microscópica de una proción significativa de la muestra, entre porta y cubre, adicionada o no de una gota de solución fisiológica estéril. que puede suministrar en diagnóstico presuntivo inmediato, y ayudar en la selección del medio de cultivo adecuado. Si la muestra es LCR se hace la observación con tinta china, para ello se centrifuga el líquido durante 10 a 20 minutos a 1500 rpm, se toma una gota del sedimento se mezcla con una gota de tinta china sobre un portaobjeto y se observa al microscopio. Esta técnica permite la detección directa de células levaduriformes capsuladas de Crptococcus neoformans.
2- Examen microscópico previa coloración de Giemsa: permite visualizar los elementos levaduriformes intracelulares del Histoplasma capsulatum
3- Examen microscópico previa coloración de Gram: evidencia la presencia de bacilos filamentosos Gram positivos, con tendencia a la filamentización de Actinomycetales.
4- Examen microscópico previa coloración de Ziehl Neelsen: para la búsqueda de BAAR, es importante descartar la presencia de los mismos ya que la matoría de las micosis profundas mimetizan los signos y síntomas de la tuberculosis en sus distintas manifestaciones.
5- Cultivo: el medio recomendado es Agar Sabouraud y Agar infusión cerebro corazón, en general al agar para hongos se le adicionan antibióticos como cicloheximida, cloramfenicol o gentamicina para inhibir el desarrollo de bactaerias contaminantes de las muestras que pueden suprimir el desarrollo de hongos contaminantes que generalmente son de crecimiento lento. Los cultivos se incuban a 25º y a 37ºC. a 25ºC desarrolla la forma saprofítica del hongo y a 37ºC desarrolla la forma parasitaria, con excepción del Coccidioides inmitis

Identificación de hongos patógenos

Cuando se encuentra un cultivo micótico positivo se debe determinar la patogenicidad potencial del aislamiento, y si el hongo aislado en el cultivo es uno de los patógenos dimórficos. Para ello se deben observar las siguientes características:
1- Crecimiento rápido: esto es desarrollo de una colonia madura en 5 días, en general los hongos dimórficos son de crecimiento lento y requieren dos semanas o mas para desarrollar, excepto algunas cepas de Coccidioides inmitis.
2- Aparición de pigmentación brillantemente coloreada: los mohos de crecimiento rápido producen esporas brillantemente coloreadas en cambio los hongos dimórficos por lo general son blancos, marrones o grises.
3- Producción de pigmentos solubles en agua que difunden en el agar: el hongo dimórfico puede producir coloración marrón o negra sobre el reverso de la colonia.
4- Inhibición del crecimiento en agar con antibióticos como la cicloheximida: los hongos dimórficos  no son inhibidos.
5- Demostración de crecimiento dimórfico con diferentes temperaturas de incubación: se demuestra la conversión a levadura cuando se incuba un subcultivo de la colonia del moho a 35-37ºC en un medio apropiado.
6- Por ultimo debe realizarse la identificación definitiva del hongo por sus características macro y microscópicas de las colonias. En el caso de desarrollo de levaduras se realizan pruebas de fermentación de hidratos de carbomo para su identificación.

Métodos de diagnóstico indirectos

Intradermorreacciones: En las micosis sistémicas, las intradermorreacciones tienen valor diagnóstico de infección actual o pasada, pero no tienen valor de diagnóstico de enfermedad. Por ejemplo la coccidioidina e histoplasmina.

Reacciones serológicas: en las micosis sistémicas, histoplasmosis, paracocciodioidomicosis, coccidioidomicosis, blastomicosis, la prueba serológica tamiz utilizada es la inmunodifusión en gel de agar o la contrainmunoelectroforesis. Ambas técnicas tienen una especificidad del 90% y una sensibilidad de 80%. Su positividad indica infección activa o reciente y en casos positivos se debe proceder a la cuantificación de anticuerpos por fijación de complemento o enzimoinmunoensayo. Estas dos técnicas si bien son más sensibles, presentan menor especificidad, manifestada por alrededor de 30% de reacciones cruzadas.
Los títulos de anticuerpos en estas micosis son proporcionales al número de unidades infectantes, es decir, a la gravedad de la enfermedad y descienden cuando el paciente evoluciona favorablemente con el tratamiento.
En la actualidad se están implementando nuevas técnicas de biología  molecular, no aplicables todavía al diagnóstico diario de laboratorio.