VIROLOGIA. DIAGNOSTICO VIROLOGICO. METODOS DIRECTOS

La necesidad de disponer de microscopio electrónico para visualizar los virus ha limitado su observación durante muchos años a centros especializados. Consecuentemente su observación en los tejidos y secreciones no ha constituido un paso habitual del diagnóstico de las infecciones víricas en los laboratorios de microbiología clínica.

En la actualidad existen métodos para detectar los virus mediante microscopía óptica. Naturalmente no permiten la visualización individualizada de los viriones, sino la presencia de grandes acúmulos de material vírico intracelular, que pueden teñirse y constituyen los denominados cuerpos de inclusión (véase más adelante).
La utilización de anticuerpos marcados con sustancias fluorescentes permite detectar en las células infectadas los antígenos víricos específicos formando acúmulos o distribuidos de forma difusa.
Este tipo de observaciones puede hacerse tanto sobre tejidos humanos infectados naturalmente como sobre cultivos celulares inoculados en el laboratorio.

Aislamiento y propagación de los virus

Los virus, a diferencia de los que sucede con la mayoría de las bacterias, hongos y protozoos, sólo pueden multiplicarse en el interior de células vivas, no pudiendo hacerlo en un medio nutritivo carente de células.
Los sistemas celulares utilizados para propagar los virus en el laboratorio son:

animales de experimentación
embriones animales
cultivos celulares artificiales.

Animales de experimentación. La inoculación a animales de experimentación de muestras clínicas o de virus para su aislamiento o propagación, es una técnica poco empleada por las dificultades de mantener un estabulario, la laboriosidad de la inoculación y el peligro de difusión del virus con las excretas de los animales. Se emplea únicamente cuando se trata de propagar virus cuya replicación en los otros sistemas –embriones o cultivos celulares– no es posible.
Los animales más utilizados para este fin son los monos, los cobayos y los ratones lactantes, que se utilizan esporádicamente para el aislamiento de un número limitado de virus y en general en laboratorios de investigación.

Embriones animales. Los más utilizados son los embriones de pollo (huevos de gallina fecundados). Los huevos fecundados se incuban hasta el momento de su inoculación que suele oscilar entre 6 y 14 días. Las inoculaciones, que pueden realizarse en diversas zonas del embrión, requieren experiencia para su realización. La inoculación en la cavidad amniótica es las más utilizada para el aislamiento de virus a partir de muestras clínicas. Este sistema es el más adecuado para el aislamiento de los virus de la gripe.

Cultivos celulares. Se denomina cultivo celular a la multiplicación y mantenimiento de células in vitro
Las células se obtienen de un fragmento de un órgano como el riñón, el pulmón u otros, por trituración y posterior disgregación con tripsina, lo que permite obtener células aisladas que se introducen en frascos con medios de cultivo adecuados. Los cultivos celulares, por tanto, están formados por células disgregadas que han perdido su organización tisular, a diferencia de los cultivos de tejidos u órganos en que se conserva esa estructura.
Las células en los frascos pueden estar en suspensión, es decir, libres en el medio de cultivo líquido o adosadas a la pared del frasco, como unas baldosas, y bañadas por el medio. En el primer caso se trata de células en suspensión y en el segundo en monocapa.
Se denomina cultivo celular primario en suspensión o monocapa, al obtenido a partir de las células normales de un órgano de un animal adulto. Estas células se mantienen vivas algún tiempo en el cultivo, pero no pueden propagarse in vitro. Se denominan líneas celulares o cultivos celulares de línea a los que tras la obtención de las células de un órgano o tejido pueden propagarse posteriormente in vitro.
Existen varios tipos de células de línea, como las de tejidos embrionarios, que sólo permiten alrededor de 50 subcultivos y mueren y las células de tejidos neoplásicos, que se propagan indefinidamente y se denominan líneas celulares continuas, confirmándose este hecho cuando se han propagado durante más de 70 pases.
Los virus o las muestras clínicas se inoculan a estos cultivos celulares. Según el virus que se pretende aislar se utiliza uno u otro sistema celular.

Acción citopática

Se denomina acción citopática la lesión que causan algunos virus a las células en que se replican.
Las lesiones celulares pueden ser intensas y precoces, produciendo en 24 o 48horas la muerte celular, acompañada de lisis fácilmente observable al inspeccionar los cultivos celulares con un microscopio. En otras ocasiones las alteraciones morfológicas que se producen en las células son mínimas o tardías y muy difíciles de detectar.
En las células infectadas por determinados virus pueden observarse cuerpos de inclusión, acompañando a las alteraciones celulares más o menos importantes. Los cuerpos de inclusión pueden visualizarse, después de la tinción de las células con hematoxilina eritrosina, como masas con morfología más o menos característica y localización nuclear o citoplasmática típica, según los virus que los originan. Están constituidos por acúmulos del material vírico sintetizado depositados en zonas celulares alteradas; en ocasiones predomina o es exclusivo el depósito de material vírico y en otras lo prominente o exclusivo es la lesión celular.
El aspecto particular y característico de cada tipo de inclusión suele orientar sobre el grupo de virus que la produce. La formación de cuerpos de inclusión ocurre tanto in vivo, en las infecciones naturales, como en los cultivos celulares infectados.
Ya se ha señalado que, aparte de la acción citopática directa, la lesión de las células infectadas por un virus puede deberse a la respuesta inmune dirigida contra antígenos codificados por el virus y expresados en la superficie celular.

Detección de ácidos nucleicos

El método mas utilizado para detección de acidos nucleicos es la Reacción en Cadena de la Polimerasa, PCR, que es una reacción de amplificación de ácidos nucleicos, que utiliza una ADN polimerasa y oligonucleótidos cebadores, primers, para producir luego de varios ciclos, millones de moléculas del fragmento seleccionado a partir de una sola copia. Los productos de PCR pueden ser detectados por tinción con bromuro de etidio y electroforesis en geles de agarosa.
Esta técnica permite detectar mínimas cantidades de ácidos nucleicos en muestras clínicas y por lo tanto ha significado un gran avance con respecto a los métodos convencionales.

Las siguientes imágenes correponden a la observación directa por microscopía electrónica de distintos virus

adenovirus